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技術支持

核酸提取方法、純化及相關應用場景

更新時間??2022-08 閱讀 155


1.1


摘要


核酸是由許多核酸聚合而成的生物大分子化合物,是生命最基本的物質之一。核酸廣泛存在于所有動物、植物細胞、微生物和生物體中核酸常與蛋白質結合形成核蛋白。核酸、化學的組成不同,核酸序列也不同。根據化學、核酸的組成可分為核糖核酸,簡稱RNA和脫氧核糖核酸,簡稱DNA。


DNA是儲存、復制和傳遞遺傳信息的主要物質基礎,RNA在蛋白質的合成中起著重要作用,其中轉運核糖核酸,簡稱tRNA,起著攜帶和轉運活性氨基酸的作用:mRNA是合成蛋白質的模板;核糖體核酸,簡稱rRNA,是細胞合成蛋白質的主要場所。



1.2


核酸提取樣本


常見樣本:血液、動植物組織、細菌、細胞、病毒、骨髓、體液等。


疑難樣本:唾液、痰液、土壤、糞便、毛發、石蠟包埋組織、骨骼、牙齒、指甲、煙頭等。

核酸提取儀.jpg


1.3


核酸提取方法


核酸兩個分子,包括DNA和RNA,在細胞內與蛋白質結合。核酸提取的主要步驟是:裂解細胞去除與核酸結合的蛋白質和生物大分子如多糖和脂質,以及其他不需要的核酸分子,如提取。沉淀核酸純化核酸去除鹽和有機試劑等雜質。


1.3.1堿裂解法


堿裂解法是基于DNA變性和復性的差異來達到分離的目的。


1.3.2.煮沸法


煮沸時,樣品中的DNA在核酸裂解物的作用下釋放出來。離心沉淀后去除雜質,上清液可用于PCR擴增。


1.3.3濃鹽法


RNA和DNA在電解質溶液中的溶解度不同而被分離。常用的方法是用1M氯化鈉提取它們。用含有少量辛醇的氯仿搖動獲得的DNP粘液,乳化,然后離心除去蛋白質。此時,蛋白質凝膠停留在水相和氯仿相的中間,而DNA處于上層水相,用2倍體積的95%乙醇可提取/kloc。


1.3.4苯酚提取法


作為一種蛋白質變性劑,苯酚也抑制脫氧核糖核酸酶的降解。當勻漿用苯酚處理時,由于蛋白質與DNA之間的鍵已經斷裂,蛋白質分子表面含有許多類似苯酚的極性基團。蛋白質分子溶于酚相,而DNA溶于水相。分離后,取出水層,重復操作多次,然后將含有DNA的水相合并,利用核酸不溶于乙醇的性質,將DNA用乙醇沉淀。此時DNA是一種非常粘稠的物質,可以用玻璃慢慢繞成一團取出。該方法的特點是將提取的DNA保持在自然狀態。


1.3.5水浸提法


根據核酸的水溶性,組織細胞破碎后,用低鹽溶液去除RNA,然后將沉淀物溶于水,使DNA完全溶于水。離心后,收集上清液,向上清液中加入固體氯化鈉以調節至2。6M。加入兩次95%的酒精,攪拌下立即攪拌出來,然后分別加入66%和80%的酒精。后風干得到DNA sample。這種方法提取的DNA蛋白質含量較高,一般不使用。為了去除蛋白質,可以對這種方法進行改進,在提取過程中加入SDS。


1.3.6陰離子洗滌劑法


蛋白質可用SDS或二甲苯鈉等去污劑變性,DNA可直接從生物材料中提取。由于DNA與蛋白質在細胞內常以靜電引力或配位鍵結合,又由于陰離子去污劑能破壞這種價鍵,DNA常被陰離子去污劑提取。


1.3.7硅膠薄膜法


可用于手動提取或自動提取。



硅膠法核酸萃取


1.3.8磁珠法


生物磁珠是一種新型的功能性固體載體,通常用于自動提取,其表面包覆有活性基團,可與多種生物活性物質偶聯。它們還具有液體流動性和固體磁性材料的特性。它們可以在外部磁場的作用下定向移動和定居。去掉外磁場后,稍加振蕩或抽吸,它們就能均勻地分散在液體中,從而使固液相的分離變得非常迅速和方便。通過簡單的洗脫,可以獲得高純度的靶向。



1.5


提取核酸的目的


高完整性和高純度的核酸分子的提取是下游分子生物學實驗的基礎。所以高質量的核酸提取是必不可少的,他可以做很多很多的分子生物學實驗。這里簡單介紹一下常見的分子生物學實驗。


1.5.1個PCR


聚合酶鏈式反應(簡稱PCR)是一種分子生物學技術,通過擴增的方法擴增出特定的DNA片段??梢钥醋魇且环N特殊的DNA體外復制。PCR(聚合酶鏈式反應)的原理是DNA在體外95℃的高溫下會變成單鏈,低溫下(一般60℃左右)引物和單鏈會根據堿基的互補配對結合,然后將溫度調整到DNA聚合酶的最適反應溫度(72℃左右),DNA聚合?;诰酆厦傅腜CR儀其實就是一個溫控裝置,可以很好的控制變性溫度、復性溫度和延伸溫度。


1.5.2轉基因


轉基因技術是指將基因片段轉入特定生物體內,最終獲得具有特定遺傳性狀的個體的技術。無論轉移的基因來自進化樹上更遠的物種,接受者都可以讀取它。這是因為DNA是一個通用代碼,細胞知道如何讀取它。即使是最密切相關的物種,如人類和細菌,也有許多相同的基因,這些基因在數十億年中保持不變?;驈哪睦飦聿皇顷P鍵,發揮的功能就是它們的功能,所以轉入動物基因的植物不會有動物的味道。


轉基因技術的理論基礎來自于進化衍生的分子生物學?;蚱蔚膩碓纯梢允翘崛√囟ㄉ锘蚪M所需的目的基因,也可以是人工合成的具有特定序列的基因片段。將基因片段轉入特定生物體內,與其自身基因組重組,然后從重組體中人工繁殖世代,從而獲得具有特定遺傳性狀的個體。這項技術可以增加重組生物的預期新性狀,培育新品種。


1.5 .3基因文庫的構建


用限制性酶部分消化生物體的基因組DNA并將限制性片段插入載體DNA分子中。插入了基因組DNA片段的所有這些載體分子的集合將包含該生物體的整個基因組,即構成該生物體的基因文庫。將這些載體引入受體細菌或細胞,使得每個細胞包含基因組DNA片段和載體重組DNA分子。經過繁殖和擴增后,許多細胞一起包含了生物體的全部基因組序列。我們稱這種集合體為基因庫。


將某一生物細胞的total DNA或染色體DNA的所有片段通過重組DNA技術隨機連接到基因載體上,然后轉入合適的宿主細胞,通過細胞增殖形成每個片段的克隆系統(克隆)。當制備的克隆的數量足夠大以包括某一生物體的所有基因時,整組克隆將是相同的定義也適用于線粒體DNA或葉綠體DNA生物體的基因文庫。因為DNA片段的截斷點是隨機的,所以每個克隆中包含的DNA片段可能是一個或幾個基因,也可能是一個基因的一部分,或者除了完整基因之外還包含兩側相鄰的DNA序列。


1.5.4分子測序


用DNA聚合酶合成與模板互補的DNA鏈,在三維空間記錄模板位置和核苷酸序列信息,然后反向構建模板的序列。除了DNA合成反應的三要素(模板、酶、核苷酸)外,模板的位置和單色熒光標記的核苷酸序列在反應循環中的位置(如何A、C、G、T)也是最終DNA序列要完成的關鍵要素。如果用四種不同的熒光標記反應中使用的核苷酸,那么在每個反應循環中就需要切換不同波長的光來記錄不同的堿基。


1.5.5分子診斷


分子診斷:利用分子生物學方法檢測患者體內遺傳物質的結構或表達水平的變化來做出診斷的技術,稱為分子診斷。分子診斷是預測性診斷的主要方法,既可用于個體遺傳病,也可用于產前診斷。分子診斷材料包括DNA、RNA和蛋白質。


分子診斷主要是指檢測編碼與疾病相關的各種結構蛋白、酶、抗原、抗體和免疫活性分子的基因。


1.5.6親子鑒定


親子鑒定是運用法醫學、生物學、遺傳學的理論和技術,從子代和父母的形態結構或生理功能上分析遺傳特征,判斷父母和子女是否親生。親子鑒定是司法物證鑒定的主要組成部分。親子鑒定在中國古代就有了,比如骨滴、血滴。


DNA親子鑒定的操作步驟如下:


步驟1: DNA提取


將樣品細胞核中含有的DNA提取出來,然后純化除去樣品中的雜質。


二步:PCR擴增


PCR的中文名字叫聚合酶鏈式反應。簡單來說,華科基因PCR擴增的步驟就是通過酶促反應,在PCR儀上大量復制出我們需要的片段,擴增到可以通過一些特殊的儀器看到的程度。


步驟3:后PCR反應


這一步主要是在ABI測序儀檢測的準備階段。雙鏈DNA是開放的,增加了一些檢測的內標,主要是標記檢測到的片段長度。


步驟4:用毛細管測序儀檢測。


因為DNA是帶電荷的,毛細管電泳不同片段DNA長度的電泳速度不同。在同樣的電壓下,同樣的電泳時間,游泳距離是不一樣的。這些不同的距離可以通過前期加入的內標測量來區分,并通過一定的軟件顯示在電腦上,方便檢測人員對數據進行處理和分析。


第五步:分析數據,出具報告。


主要檢測人員會對得到的結果進行分析、匯總、計算,然后拿出鑒定結論和報告。


1.5.7法醫鑒定


司法鑒定是司法程序中技術工作的重要組成部分。是運用醫學、生物學、人類學、物理學、化學等知識對活體、尸體以及與人有關的生物證據的檢驗和鑒定。,從而獲得死因、損傷程度、兇器類型、血型分析、事實確認等結論性意見。司法鑒定結論是三大訴訟法中的重要證據類型。由于與人身關系密切,司法鑒定結論在訴訟和非訴訟活動中具有重要意義。它是查明案件事實、區分案件性質的重要依據。同時也是鑒定案件其他證據是否真實的重要手段??梢哉f,司法鑒定的質量在一定程度上影響著司法公正。


1.5.8基因敲除


敲除(Knockout)是指一種基因工程技術,針對功能已知但未知的序列,改變生物體的遺傳基因,使特定基因的功能失去作用,從而使部分功能被阻斷,可以進一步影響生物體,進而推斷該基因的生物學功能。


基因敲除和基因嵌入是上世紀90年代出現的新外源DNA導入技術?;蚯贸且环N基因打靶技術,類似于基因的同源重組。是指外源DNA基因與受體細胞基因組中相同或相似序列的同源重組,從而替換受體細胞基因組中相同/相似的基因序列,并整合到受體細胞基因組中。這種方法可以產生準確的基因突變,糾正生物體的基因突變?;蚯度胗址Q基因置換,是利用內源基因序列兩側或外側的斷點,將內源基因完全替換為同源序列的目的基因。目前用于基因敲除和基因嵌入的有Cre/Lox P系統、FLPI系統等。


1.5.9基因芯片


基因芯片(genechip,又稱DNA chip,生物芯片)的雛形于20世紀80年代中期提出?;蛐酒臏y序原理是雜交測序法,即與一組已知序列的核酸探針雜交確定核酸序列,將8個已知序列的核苷酸探針固定在一個基片表面。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTAG與基因芯片上相應位置的核酸探針互補匹配時,通過確定熒光強度強的探針的位置,可以得到一組序列完全互補的探針序列。所以target 核酸的序列可以重組。


1.5.10 .動植物資源的保存和鑒定


建立瀕危野生動植物遺傳資源庫,實施瀕危野生動植物遺傳保護工程,對于我國瀕危野生動植物的保護和繁衍,對于維護我們賴以生存的環境生物多樣性和生態鏈平衡,無疑具有重要意義。然而,對于已經進入生物經濟時代的人類來說,其意義遠不止于此。


提取高質量的核酸在其他領域和方向有重要作用。但是僅僅依靠傳統的核酸萃取方式,很難滿足日益增長的中文核酸萃取市場,所以全自動核酸自動萃取器的出現將為中文核酸萃取市場帶來一抹亮色。